1. 該模型鑒定和評價的技術方法和指標體系，符合潰瘍性結腸炎的病理特點，尤其與潰瘍性結腸炎反復發(fā)作、遷延不愈的臨床特點高度相似。

（1） 疾病活動指數(shù)

（2） 結腸指數(shù)

（3） 結腸組織大體評分

（4） HE 染色病理觀察

（5） MPO 酶活性檢測

2. 與國內外現(xiàn)有模型的異同

現(xiàn)有的潰瘍性結腸炎的造模方法有單一化學法刺激、免疫法、免疫復合法、基因修飾法。雖然現(xiàn)在建造UC動物模型的方法多種多樣，但是依舊存在著或多或少的缺陷。理想模型要簡單易操作，同時盡可能全面、準確的模擬人類UC的病理生理學特點和表現(xiàn)，既要與自發(fā)的炎癥誘因相近，又要符合腸道炎癥進展、組織損傷進展等，同時模型病變盡量維持較長時間，能盡量反映慢性病變的過程和特點，以滿足實驗的需求。而目前尚缺乏能滿足這些要求的模型，且已有模型以急性損傷模型為主。故亟待尋找更好的，具有良好重復性、穩(wěn)定性，并且操作簡單的動物模型，從而為研究UC發(fā)病機制、研發(fā)治療新藥物提供良好的基礎。

3. 本研究的主要創(chuàng)新點或技術關鍵

3.1 創(chuàng)新點

本模型采用誘導劑聯(lián)用的方法，建立慢性、炎癥維持時間長且病程穩(wěn)定的小鼠慢性 UC 造模方法。該模型改進了傳統(tǒng)潰瘍性結腸炎模型的病程短、穩(wěn)定性差、模型指標缺少特異性等問題，更大程度的模擬了臨床慢性潰瘍性結腸炎病理指標。

3.2 關鍵技術

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸兩種誘導劑聯(lián)用、致敏與感染相結合的方法，建立了新慢性、炎癥維持時間長且病程穩(wěn)定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通過閱讀大量中外文獻，較充分的了解潰瘍性結腸炎疾病以及模型建立過程中的問題。

4.2 實驗單位具備動物飼養(yǎng)許可證以及較先進的實驗器材和檢測設備。

4.3 通過閱讀大量中外文獻和走訪調研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在臨床上應用廣泛，效果明顯，具有可行性。

本實驗采用昆明種6-8周齡的健康成年小鼠，體重均在33±2g，SPF級。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京斯貝福生物科技股份有限公司，動物用水為實驗室制UP水經(jīng)過除菌處理。飼養(yǎng)及實驗操作均于具有檢驗合格資質的SPF級屏障動物室內進行，并且實驗動物以完整的包裝直接進入屏障實驗室，觀察室適應7天后無異常情況，方可進行實驗。所有實驗中小鼠均引頸處死，盡量減少動物手術創(chuàng)傷程度及失血量。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關法律規(guī)定。

1. 左肺彌漫性出血、滲出，而右肺損害不明顯。

Fig1 肺部大體解剖

2. 肺泡灌洗液白細胞計數(shù)和蛋白濃度、肺濕干重比結果見表3~5。I ) 鹽酸組與生理鹽水組比較，肺泡灌洗液中白細胞計數(shù)呈顯著增加；除30 min時間點， HCl組與相對應的各個時間點NS組的比較，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，并在6 hHCl組達到峰值(P值＜0.01)。II ) 肺泡灌洗液蛋白濃度6 h NS組時BALF蛋白濃度出現(xiàn)輕度升高(P值＜0.05 vs 12 h組)；HCl刺激6 h時達峰值并明顯高于6 h NS組及其它時間點HCl 組。III )左肺肺濕干重比值(W/D)在HCl刺激30 min時明顯升高，12 h達峰值后呈下降趨勢，至24小時進一步恢復。

3. TNF-α、IL-6、IL-1β和NF-κB免疫印跡檢測

NS組各時間點組肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β和NF-κB的蛋白表達量無顯著差異， HCl組6、12和24 h顯著升高( P值＜0.01 vs NS組)，在12 h HCl組達到峰值( P＜0.05 vs 6 h 、24 h HCl組，F(xiàn)ig2)；肺組織IL-6蛋白表達量比較HCl組30 min開始顯著升高( P＜0.01 vs NS組)， 6 h HCl組達到峰值( P＜0.01 vs NS組，P＜0.05 vs 30 min、24 h HCl組，F(xiàn)ig3)；肺組織IL-1β 蛋白表達量比較，HCl組30 min開始顯著升高( P＜0.05 vs NS組)，在6 h HCl組達到峰值( P＜0.05 vs NS組， P＜0.05 vs 2 h、24 h HCl組，F(xiàn)ig4)；肺組織NF-κB蛋白表達量比較，HCl組30 min開始升高，在2 h、6 h和12 h HCl組表達量顯著升高( P＜0.05 vs NS組，F(xiàn)ig5)。

4.病理學結果及肺損傷評分

NS組各時間點肺組織觀察可見肺泡結構完整、清晰，無損害( Fig6 )；30 min HCl 組的肺組織未見明顯損害或輕微損害，肺泡結構較完整, 肺泡間隔無明顯水腫，有少量炎性細胞浸潤( Fig6B)；2 h HCl組，彌漫性肺泡壁增厚、紅細胞滲出和炎性細胞浸潤( Fig6D黑色箭頭所示)；6 hHCl組，肺組織損害顯著，肺組織彌漫性的出血、水腫，肺泡壁增厚、結構紊亂，部分肺泡萎陷不張( Fig6F黑色箭頭所示)；12 hHCl組較6 h HCl組損害程度減輕，肺間質輕中度水腫，肺泡結構破壞程度以及炎性細胞浸潤較6 h組減輕(Fig6H黑色箭頭所示)；24 hHCl組，肺組織水腫充血程度仍然較重，與6、12 h組相比肺部炎癥程度較輕( Fig6J黑色箭頭所示)。HCl 組與NS組各個時間刺激點相比較， (除外30 min) 的肺組織病理損傷評分顯著升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)；并且HCl組，6 h HCl 組肺損傷評分與2 h、12 h HCl組比較顯著升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P值＜0.05)。

Fig6 小鼠肺病理學改變 (H&E染色 ×400)

Fig7 肺損傷評分 與NS組比較顯著升高 *P值＜0.001；6h組與2 h、12 h HCl組比較顯著升高 #P值＜0.05；

5. 肺組織免疫組化結果

CD3為T淋巴細胞膜表面標記物，12 h HCl 組可見肺間質出現(xiàn)T淋巴細胞(CD3+)(Fig8H)，24 h時仍大量存在(Fig8J)；以CD68為細胞膜表面標記物的巨噬細胞，在6 h HCl 組的肺間質出現(xiàn)( Fig9F)，至24 h時仍然大量存在(Fig9J)；Gr-1主要為粒細胞膜表面標記物，30 min HCl 組開始在肺泡間質出現(xiàn)，部分與肺泡壁黏附，至24 h時仍然大量存在(Fig10)。

Fig8 肺組織CD3免疫組化-T淋巴細胞 (×400)

Fig9 肺組織CD68免疫組化-巨噬細胞 (×400)

Fig10 肺組織Gr-1免疫組化-嗜中性粒細胞 (×400)

呼吸功能(Pehn)： HCl刺激小鼠6-12 h時出現(xiàn)Pehn明顯升高，提示起到阻力顯著增加

Tab 6 各組呼吸功能 Pehn(x±s)

*P值＜0.01 vs相應時間點NS組; #P值＜0.05 vs 2 h組; ▲P值＜0.05 vs 24 h組

1. C57bL/6J小鼠 ，名稱：C57bL/6J，近交系（Inbred Rat）

品系來源 ：1921年 C.C.Little用 Lathrop小鼠作近親培育時，用No7雄鼠和No.52雌鼠交配，培育成C57。在C57中將毛色呈黑色的進行固定，培育成C57BL。1937年Ltle將維持的C57BL第六組亞系定名為C57BL6，將第十組亞系定名為C57BL10，繼而分別維持至今。1947年從 Little引入到美國 Jackson Lab，形成C57BL/6J:1951年從 Jackson Lab將第32代引入到NH，形成c57BL6N亞系；1974年 Charles River從NH引入并于1975年進行了剖腹產(chǎn)。六十年代從 Jackson Lab引入到日本實驗動物中央研究所,1986年自日本實驗動物中央研究所引入到中科院上海實驗動物中心。2001年中國北京維通利華從美國 Charles River引入第59代核心群。

2. 鹽敏感大對照鼠SS-13BN Rat，名稱：SS-Chr13BN/McwiCrlVr，?同類系（Consomic Rat）

3.誘導方法：自制氣管滴注導管，動脈導管( 內徑0.28mm,427401, BD Intramedic PE Tubing)，長度4cm，插入端加熱制成一定弧度，動物麻醉后頸前暴露氣管，充分暴露喉部以及聲門，配合冷光源的使用，可見光源由聲門處透射出并隨聲門開合呈現(xiàn)閃爍感( Fig2A)；于聲門張開瞬間，右手持導管向前上方平穩(wěn)插入氣管，有輕微突破感，拔出導絲，調整導管向左側彎曲，緩慢向氣管深處插入，深至距小鼠上門牙約2.8cm以確保導管末端置于左主支氣管內，末端連接胰島素注射器，向導管內緩慢推注0.1M濃度鹽酸或生理鹽水對照），推注過程大于10s，再補推注入約30倍液體體積的空氣。豎直放置小鼠5min，術后小鼠給予保溫措施等待蘇醒，密切觀察至72h，存活動物為成功造模動物。

急性肺損傷(acute lung injury，ALI）是由非心源性的各種嚴重肺內外致病因素如嚴重感染休克、創(chuàng)傷、DIC、誤吸等原發(fā)疾病引起，臨床主要表現(xiàn)為急性進行性加重的呼吸困難和難治性低氧血癥,進一步發(fā)展可演變?yōu)榧毙院粑狡染C合征(ARDS）[1]。雖然ALI的病因多樣，但研究顯示它們是嚴重損傷引起機體全身免疫炎癥反應失控過程中的不同階段。而肺臟則是這一過程中最易受損的首位靶器官，所以ARDS出現(xiàn)最早發(fā)病率也最高。

正常的肺組織由肺泡上皮細胞和微血管內皮兩大系統(tǒng)構成良好的肺泡毛細血管的屏障。無論哪種原因的損傷通過氣道(直接肺損傷還是毛細血管(間接肺損傷))，而最終的結果是導致彌漫性的肺泡損傷[2]。當直接肺損傷因素作用于肺時，損傷首先累及肺泡上皮并促使肺泡巨噬細胞和炎癥反應鏈的激活，導致肺內炎癥反應，進而導致肺泡上皮的損傷。因此肺內源性ARDS病理表現(xiàn)為以肺泡腔內改變?yōu)橹饕鸱闻萸粌人[纖維蛋白、膠原蛋白滲出和中性粒細胞聚集，可合并肺泡內出血導致肺實變。而當間接肺損傷因素激活全身炎癥反應肺外炎性介質通過循環(huán)系統(tǒng)進入肺內，肺作為全身炎癥反應的靶器官引起進一步損傷的首先導致肺血管充血血管內皮細胞損傷血管通透性的增加及單核細胞淋巴細胞、多核細胞、血小板等炎性細胞的聚集，進而引起肺小血管的充血和肺間質水腫導致肺泡萎陷，但肺泡腔的結構一般正常。[3]利用小鼠HCl單側吸入性急性肺損傷模擬人類臨床急性肺損傷病變。