人源化狼瘡菌群移植小鼠模型
討論與結(jié)論
為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細胞中的功能，我們運用CRISPER/Cas9技術(shù)對斑馬魚npsn進行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發(fā)生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經(jīng)預(yù)測它們的蛋白結(jié)構(gòu)相對于野生型斑馬魚出現(xiàn)移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測發(fā)現(xiàn)在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結(jié)果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導(dǎo)致了mRNA的全面降解所導(dǎo)致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產(chǎn)生后代。
為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細胞的發(fā)育，我們通過斑馬魚中性粒細胞特異性標(biāo)記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體和野生型斑馬對比，mpx+和lyz+信號點的數(shù)量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發(fā)現(xiàn)SB+陽性細胞的數(shù)量也沒有差異。并且進一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細胞中的顆粒，也未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細胞的發(fā)育和數(shù)量。這可能是因為Npsn只是斑馬魚中性粒細胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細胞的發(fā)育，但是可能影響了中性粒細胞的某些功能。
為了研究Npsn缺陷對斑馬魚中性粒細胞功能的影響，而中性粒細胞的主要功能是參與機體的固有免疫反應(yīng)，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實驗。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對于野生型胚胎顯著下降，體內(nèi)殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細胞在抵抗細菌感染中存在功能缺陷。為了進一步驗證Npsn在中性粒細胞抵抗感染中的作用，我們通過構(gòu)建斑馬魚Npsn過表達的轉(zhuǎn)基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)Npsn過表達后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個結(jié)果進一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細菌感染。
但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細胞抵抗感染的呢？先前有體外實驗證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細胞外基質(zhì)的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細胞的遷移來影響對大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗證這個觀點，我們觀察了在感染后4小時時傷口處中性粒細胞的數(shù)量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細胞的完整性，進而影響大腸桿菌在機體內(nèi)存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發(fā)現(xiàn)Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細胞抵抗細菌感染的具體機制，還需要更多的實驗來驗證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應(yīng)模型，對研究在感染過程中，中性粒細胞與病原菌的相互關(guān)系，以及對研發(fā)新的抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義。
生物安全性
動物模型的制備和應(yīng)用實驗必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實驗室開展。動物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國家相關(guān)法律規(guī)定。
評價驗證
悉生小鼠在進行狼瘡病人糞菌移植后，表現(xiàn)升高的dsDNA。
狼瘡患者糞便溯源分析
制備方法
1、（細胞/基因/病原/其他造模因素）信息
狼瘡病人和狼瘡小鼠的腸道菌群紊亂。
2、實驗動物背景信息
利用悉生小鼠進行狼瘡病人的菌群移植。
活動期狼瘡病人的糞便經(jīng)研磨后，按照重量：體積=1:5由PBS混勻，離心，取上清，菌落計數(shù)，0.8X109CFU，隔天灌胃，連續(xù)5次。連續(xù)觀察2個月，當(dāng)出現(xiàn)dsDNA升高時，表示模型成功。
研究背景
系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種全身性、系統(tǒng)性的自身免疫性結(jié)締組織病，多好發(fā)于女性。絕大多數(shù)患者發(fā)病時即有多系統(tǒng)損害表現(xiàn)，同時伴有其他的結(jié)締組織病。該病臨床表現(xiàn)多樣，可由于狼瘡腎炎、狼瘡腦病等危及患者生命。其發(fā)病與遺傳和環(huán)境相關(guān)。腸道菌群有可能在發(fā)病中發(fā)揮一定的作用。dsDNA升高和狼瘡腎炎、T細胞和B細胞異常激活等是主要特征，同時伴有腸道菌群紊亂
模型信息
中文名稱:人源化狼瘡菌群移植小鼠模型
英文名稱:human lupus microbiota-associated mice
類型:免疫性疾病動物模型
分級:NA
用途:為國際上首次用狼瘡病人的腸道菌群移植到悉生小鼠，并表現(xiàn)出狼瘡相應(yīng)的癥狀。
研制單位:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所
保存單位:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所
